[摘要]目的探讨年龄相关性听力损失对小鼠学习记忆能力的影响。方法取4周龄昆明小鼠14只，随机分为对照组和模型组，模型组小鼠每日腹腔注射150mg/（kg·d）的d-半乳糖诱导年龄相关性听力损失（arhl）模型，对照组腹腔注射同等剂量的生理盐水，持续2个月。分别于注射前及注射后1个月和2个月，检测小鼠听力的损害。听脑干反应（abr）检测小鼠听觉功能，morris水迷宫实验检测小鼠学习以及能力。结果造模2个月后模型组小鼠abr阈值显著升高，并且与对照组相比，存在显著性差异（p<0.01），arhl小鼠模型造模成功。arhl小鼠潜伏期和上台前路程均显著长于对照组（p<0.05），并且在目标象限游泳时间和穿越平台次数也显著减少（p<0.05）。结论年龄相关性听力损失模型小鼠学习和记忆能力下降，记忆保持能力也有所下降。
[关键词]年龄相关性听力损失;学习记忆能力;听脑干反应;morris水迷宫。
[中图分类号]r392 [文献标识码]a [文章编号]1673-9701（2019）05-0031-03。
[abstract]objectivetoinvestigatetheeffectofage-relatedhearinglossonlearningandmemoryabilityinmice.methods14kunmingmiceof4weeksoldwererandomlydividedintocontrolgroupandmodelgroup.themiceinthemodelgroupwereintraperitoneallyinjectedwith150mg/（kg·d）d-galactosetoinduceage-relatedhearingloss（arhl）model.thecontrolgroupwasintraperitoneallyinjectedwiththesamedoseofnormalsalinefor2months.thehearingimpairmentofthemicewastestedbeforeinjectionandat1monthand2monthsafterinjection，respectively.theauditorybrainstemresponse（abr）wasusedtodetecttheauditoryfunctionofmice，andthemorriswatermazetestwasusedtodetectthelearningandabilityofmice.resultsafter2monthsofmodeling，theabrthresholdofthemodelgroupwassignificantlyincreased，andtherewasasignificantdifferencebetweenthemodelgroupandthecontrolgroup（p<0.01）.thearhlmousemodelwassuccessfullymodeled.thelatencyandthepre-stationarypathofarhlmiceweresignificantlylongerthanthatofthecontrolgroup（p<0.05），andtheswimmingtimeandthenumberofcrossingplatformsinthetargetquadrantwerealsosignificantlydecreasedinthearhlmice（p<0.05）.conclusiontheage-relatedhearinglossmodelmicehavedecreasedlearning，memoryabilityandmemoryretention
[keywords]age-relatedhearingloss;learningandmemoryability;auditorybrainstemresponse;morriswatermaze
老年性耳聋即年龄相关性听力损失（age-relatedhearingloss，arhl），是指随着年龄的增长，听觉器官发生缓慢的进行性老化，主要表现为高频听力下降，并逐渐累及低频听力。近年研究发现学者发现[1]，arhi患者数量比以前有明显增加。并且研究发现在60岁以上人群中，35%～55%患有不同程度的听力障碍[2]，而相关研究预测至2050年60岁以上人口将达4.91亿，因此arhi患者数量巨大，越来越受到人们的关注[3]。2014年franklin等的研究显示听力损失与痴呆、抑郁、平衡失调和跌倒风险的增加相关，且发生痴呆的风险随着基线听力损失的严重程度线性增加（每10db听力损失风险增加1.27倍）[4，5]。taljaard和olaithe于2016年发布了一项由5534名听力损失患者参与的大型meta分析显示听力受损程度与一般认知之间的剂量-反应关系，且听力治疗可以改善认知功能[6]。但是关于年龄相关性听力损失对小鼠学习记忆能力影响的研究较少，因此本研究对半乳糖衰老模型大鼠进行研究，明确年龄相关性听力损失对小鼠学习记忆能力的影响。1材料与方法。
1.1动物模型建立[7，8]
取4周龄昆明小鼠14只，随机分为对照组和模型组，模型组小鼠每日腹腔注射150mg/（kg·d）的d-半乳糖诱导老年性耳聋模型，对照组腹腔注射同等剂量的生理盐水，持续2个月。分别于注射前及注射后1个月和2个月，检测小鼠听力的损害。本研究通过伦理委员会批准。
1.2听脑干反应（abr）检测小鼠听觉功能[9]
听脑干反应检测在隔音屏蔽室内进行。小鼠用1%戊巴比妥钠90mg/kg经腹腔注射麻醉后，将电极的正极置于动物颅顶正中皮下，负极置于给声侧耳廓后下方，接地电极置于对侧耳廓后下方，屏蔽耳机距测试小鼠外耳道口0.5cm。应用美国智听公司smartep&oae听觉诱发电位-耳声发射记录系统给予短纯音刺激，选取8khz、12khz、24khz3个频率分别进行测试并记录。重复率39.1次/s，带通滤波100～300hz，叠加1024次，扫描时程16.0ms。声刺激强度从95dbspl开始，以5db逐次递减，听阈判定以刚出现abrⅠ波为准并至少重复2次。
1.3morris水迷宫实验[10]
选择安静、暗光、恒温环境进行测试。实验前将水桶灌以清水至预定高度（约40cm），再加入适量白色素，使水成为不透明的乳白色液体，加热器加热水温至25℃。平台置于第四象限中央，位于水面以下约1.5cm。训练期依次从4个入水点将小鼠面向池壁放入水中，记录小鼠寻找并爬上平台所需时间，即逃避潜伏期，停留30s进行下一方向的训练。如果120s内未找到平台，由实验者将其引至平台，并在平台上停留30s后进行下一方向训练。定位航行实验用于评价动物学习和记忆能力。前3d为动物训练期，第4天，依次从第一、二、三象限入水点将小鼠面向池壁放入水中，分别记录小鼠第1天、第2天、第3天和第4天在水中逃避潜伏期和上台前路程。空间搜索实验用于评价动物平台位置的记忆，即记忆保持能力。第5天撤除平台，依次从第一、二、三象限入水点将小鼠面向池壁放入水中，分别3次记录小鼠90s内在目标象限游泳时间和穿越平台次数。
1.4统计学方法
数据采用统计学软件spss18.0进行处理和分析，计量资料以（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，p<0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1abr检测结果。
注射前经过不同频率刺激，对照组和模型组小鼠abr阈值没有显著性差异（p>0.05）;注射造模后1个月，对照组小鼠abr阈值没有显著变化（p>0.05），而模型组小鼠abr阈值显著升高（p<0.05），与对照组相比，模型组小鼠abr阈值显著高于对照组，差异有统计学意义（p<0.05）;注射造模后2个月，对照组小鼠abr阈值没有显著变化（p>0.05），而模型组小鼠abr阈值显著升高（p<0.01），与对照组相比，模型组小鼠abr阈值显著高于对照组，差异有统计学意义（p<0.01），见表1。造模后模型组小鼠abr阈值变化稳定，造模成功。
2.2两组morris水迷宫定位航行实验结果。
morris水迷宫定位航行实验结果显示，模型组小鼠潜伏期明显长于对照组（p<0.05）;并且上台前路程也显著长于对照组（p<0.05），见表2。结果证实年龄相关性听力损失模型小鼠学习和记忆能力下降。
2.3两组morris水迷宫空间探索实验结果。
空间探索实验结果发现，模型组小鼠在目标象限游泳时间比对照组显著减少（p<0.05），并且模型组小鼠穿越平台次数也显著减少（p<0.05），见表3。结果证实年龄相关性听力损失模型小鼠记忆保持能力也有所下降。
3讨论
随着我国老龄化社会的到来，老年性耳聋的患病率大幅上升，据不完全统计，2017年已达到5000万，预计到2030年，arhl预计将成为疾病负担的前15个原因[11]。目前研究发现中、重度听力损失的老年患者，发生认知功能障碍的几率比正常老年人显著升高[12]。同时一项流行病学调查研究也发现听觉障碍的患者认知功能障碍发病率升高[13]，并且阿尔茨海默病发病风险也增高[14]。另外动物研究也发现，听力损失模型小鼠认知功能下降，并且研究还发现听力损失模型小鼠海马突触退变明显，这一变化可能与认知功能下降有关[15]。
半乳糖衰老模型是目前使用较为广泛的一种人工老化模型，具有衰老变化明显、模型稳定、耗时短等优点。因此本研究对小鼠进行d-半乳糖注射进行造模，结果发现，造模2个月后模型组小鼠abr阈值显著升高，并且与对照组相比，存在显著性差异（p<0.01）。造模后模型组小鼠abr阈值变化稳定，与以往研究结果一致[7，8]，arhl小鼠模型造模成功。同时，本研究应用morris水迷宫结果发现，第1、2、3、4天arhl小鼠学习能力低于对照动物（p<0.05）;随着学习时间的延长，arhl小鼠潜伏期和上台前路程逐渐缩短，显示出学习的作用，而第4天arhl小鼠学习能力仍然显著低于对照组。但在第5天的记忆测试中，arhl小鼠在目标象限游泳时间和穿越平台次数显著低于对照组（p<0.05），显示arhl小鼠海马相关的空间学习能力及空间记忆能力显著降低。结果证实年龄相关性听力损失模型小鼠学习和记忆能力下降，记忆保持能力也有所下降。内质网是细胞内蛋白质合成、加工及修饰的场所，大量未折叠及错误折叠的蛋白质在内质网腔中聚集将会引起内质网应激（endoplasmicreticulumstress，ers）。ers参与诱导内耳毛细胞的凋亡，从而引起听力损失，也参与神经细胞的凋亡，影响智力发育，这可能是年龄相关性听力损失可以降低小鼠学习和记忆能力的潜在机制。综上所述，年龄相关性听力损失可以降低小鼠学习和记忆能力。因此临床上针对年龄相关性听力损失的老年患者要注意加强锻炼学习记忆能力，必要时采取适当治疗，改善认知功能，延缓阿尔茨海默病的发生。
[参考文献]。
[1]franeescop，vincenzos，davides，eta1.age-relatedhearingimpairmentandfrailtyinalzheimer[j].frontiersinagingneuroseienee，2015，7（9）：113-119。
[2]莫文权，杨晖，褚文浩，等.中医综合疗法治疗老年感音神经性耳聋的l临床随机对照研究[j].上海中医药杂志，2017，51（8）：68-72。
[3]胡杰成.我国人口老龄化现状、趋势与建议[j].中国经贸导刊，2017，12（1）：59-62。
[4]linfr，metterej，o’brienrj，etal.hearinglossandincidentdementia[j].archneurol，2011，68（2）：214-220。
[5]linfr，albertm.hearinglossanddementia-whoislistening[j].agingmenthealth，2014，18（6）：671-673。
[6]taljaardds，olaithem.therelationshipbetweenhearingimpairmentandcognitivefunction：ameta-analysisinadults[j].clinotolaryngol，2016，41：718-729。
[7]黄双.d-半乳糖致小鼠衰老模型剂量和给药方式探讨[d].南宁：广西医科大学，2014。
[8]张海静，王哲，武莹，等.耳聋左慈丸对老年性耳聋模型小鼠血清sod，mda、pkc的影响[j].中国中医药现代远程教育，2016，14（l）：136-138。
[9]张博，陈颖，黄喜，等.参芎注射液对顺铂致小鼠耳毒性及耳蜗caspase-3表达的影响[j].实用临床医药杂志，2016，20（23）：1-4。
[10]于亚峰，翟丰，戴春富，等.c57bl/6j小鼠听力损失与认知功能下降的相关性[j].中华医学杂志，2011，91（34）：2430-2434。
[11]matherscd，loncard.projectionsofglobalmortalityandburdenofdiseasefrom2002to2030[j].plosmed，2006，3（11）：e442-446。
[12]davieshr，cadard，herberta，etal.hearingimpairmentandincidentdementia：findingsfromtheenglishlongi-tudinalstudyofageing[j].jamgeriatrsoc，2017，6（22）：1-8。
[13]fischerme，cruickshankskj，schubertcr，etal.age-relatedsensoryimpairmentsandriskofcognitiveimpairment[j].jamgeriatrsoc，2016，64（10）：1981-1987。
[14]gatesga，beisera，reests，etal.centralauditorydysfunctionmayprecedetheonsetofclinicaldementiainpeoplewithprobablealzheimer’sdisease[j].jamgeriatrsoc，2002，50（3）：482-488。
[15]王驰，柳柯，赵立东，等.老年性聋耳蜗带状突触数量在时空上的改变[j].中华耳科学杂志，2016，14（1）：32-36。
[关键词]年龄相关性听力损失;学习记忆能力;听脑干反应;morris水迷宫。
[中图分类号]r392 [文献标识码]a [文章编号]1673-9701（2019）05-0031-03。
[abstract]objectivetoinvestigatetheeffectofage-relatedhearinglossonlearningandmemoryabilityinmice.methods14kunmingmiceof4weeksoldwererandomlydividedintocontrolgroupandmodelgroup.themiceinthemodelgroupwereintraperitoneallyinjectedwith150mg/（kg·d）d-galactosetoinduceage-relatedhearingloss（arhl）model.thecontrolgroupwasintraperitoneallyinjectedwiththesamedoseofnormalsalinefor2months.thehearingimpairmentofthemicewastestedbeforeinjectionandat1monthand2monthsafterinjection，respectively.theauditorybrainstemresponse（abr）wasusedtodetecttheauditoryfunctionofmice，andthemorriswatermazetestwasusedtodetectthelearningandabilityofmice.resultsafter2monthsofmodeling，theabrthresholdofthemodelgroupwassignificantlyincreased，andtherewasasignificantdifferencebetweenthemodelgroupandthecontrolgroup（p<0.01）.thearhlmousemodelwassuccessfullymodeled.thelatencyandthepre-stationarypathofarhlmiceweresignificantlylongerthanthatofthecontrolgroup（p<0.05），andtheswimmingtimeandthenumberofcrossingplatformsinthetargetquadrantwerealsosignificantlydecreasedinthearhlmice（p<0.05）.conclusiontheage-relatedhearinglossmodelmicehavedecreasedlearning，memoryabilityandmemoryretention
[keywords]age-relatedhearingloss;learningandmemoryability;auditorybrainstemresponse;morriswatermaze
老年性耳聋即年龄相关性听力损失（age-relatedhearingloss，arhl），是指随着年龄的增长，听觉器官发生缓慢的进行性老化，主要表现为高频听力下降，并逐渐累及低频听力。近年研究发现学者发现[1]，arhi患者数量比以前有明显增加。并且研究发现在60岁以上人群中，35%～55%患有不同程度的听力障碍[2]，而相关研究预测至2050年60岁以上人口将达4.91亿，因此arhi患者数量巨大，越来越受到人们的关注[3]。2014年franklin等的研究显示听力损失与痴呆、抑郁、平衡失调和跌倒风险的增加相关，且发生痴呆的风险随着基线听力损失的严重程度线性增加（每10db听力损失风险增加1.27倍）[4，5]。taljaard和olaithe于2016年发布了一项由5534名听力损失患者参与的大型meta分析显示听力受损程度与一般认知之间的剂量-反应关系，且听力治疗可以改善认知功能[6]。但是关于年龄相关性听力损失对小鼠学习记忆能力影响的研究较少，因此本研究对半乳糖衰老模型大鼠进行研究，明确年龄相关性听力损失对小鼠学习记忆能力的影响。1材料与方法。
1.1动物模型建立[7，8]
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1.2听脑干反应（abr）检测小鼠听觉功能[9]
听脑干反应检测在隔音屏蔽室内进行。小鼠用1%戊巴比妥钠90mg/kg经腹腔注射麻醉后，将电极的正极置于动物颅顶正中皮下，负极置于给声侧耳廓后下方，接地电极置于对侧耳廓后下方，屏蔽耳机距测试小鼠外耳道口0.5cm。应用美国智听公司smartep&oae听觉诱发电位-耳声发射记录系统给予短纯音刺激，选取8khz、12khz、24khz3个频率分别进行测试并记录。重复率39.1次/s，带通滤波100～300hz，叠加1024次，扫描时程16.0ms。声刺激强度从95dbspl开始，以5db逐次递减，听阈判定以刚出现abrⅠ波为准并至少重复2次。
1.3morris水迷宫实验[10]
选择安静、暗光、恒温环境进行测试。实验前将水桶灌以清水至预定高度（约40cm），再加入适量白色素，使水成为不透明的乳白色液体，加热器加热水温至25℃。平台置于第四象限中央，位于水面以下约1.5cm。训练期依次从4个入水点将小鼠面向池壁放入水中，记录小鼠寻找并爬上平台所需时间，即逃避潜伏期，停留30s进行下一方向的训练。如果120s内未找到平台，由实验者将其引至平台，并在平台上停留30s后进行下一方向训练。定位航行实验用于评价动物学习和记忆能力。前3d为动物训练期，第4天，依次从第一、二、三象限入水点将小鼠面向池壁放入水中，分别记录小鼠第1天、第2天、第3天和第4天在水中逃避潜伏期和上台前路程。空间搜索实验用于评价动物平台位置的记忆，即记忆保持能力。第5天撤除平台，依次从第一、二、三象限入水点将小鼠面向池壁放入水中，分别3次记录小鼠90s内在目标象限游泳时间和穿越平台次数。
1.4统计学方法
数据采用统计学软件spss18.0进行处理和分析，计量资料以（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，p<0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1abr检测结果。
注射前经过不同频率刺激，对照组和模型组小鼠abr阈值没有显著性差异（p>0.05）;注射造模后1个月，对照组小鼠abr阈值没有显著变化（p>0.05），而模型组小鼠abr阈值显著升高（p<0.05），与对照组相比，模型组小鼠abr阈值显著高于对照组，差异有统计学意义（p<0.05）;注射造模后2个月，对照组小鼠abr阈值没有显著变化（p>0.05），而模型组小鼠abr阈值显著升高（p<0.01），与对照组相比，模型组小鼠abr阈值显著高于对照组，差异有统计学意义（p<0.01），见表1。造模后模型组小鼠abr阈值变化稳定，造模成功。
2.2两组morris水迷宫定位航行实验结果。
morris水迷宫定位航行实验结果显示，模型组小鼠潜伏期明显长于对照组（p<0.05）;并且上台前路程也显著长于对照组（p<0.05），见表2。结果证实年龄相关性听力损失模型小鼠学习和记忆能力下降。
2.3两组morris水迷宫空间探索实验结果。
空间探索实验结果发现，模型组小鼠在目标象限游泳时间比对照组显著减少（p<0.05），并且模型组小鼠穿越平台次数也显著减少（p<0.05），见表3。结果证实年龄相关性听力损失模型小鼠记忆保持能力也有所下降。
3讨论
随着我国老龄化社会的到来，老年性耳聋的患病率大幅上升，据不完全统计，2017年已达到5000万，预计到2030年，arhl预计将成为疾病负担的前15个原因[11]。目前研究发现中、重度听力损失的老年患者，发生认知功能障碍的几率比正常老年人显著升高[12]。同时一项流行病学调查研究也发现听觉障碍的患者认知功能障碍发病率升高[13]，并且阿尔茨海默病发病风险也增高[14]。另外动物研究也发现，听力损失模型小鼠认知功能下降，并且研究还发现听力损失模型小鼠海马突触退变明显，这一变化可能与认知功能下降有关[15]。
半乳糖衰老模型是目前使用较为广泛的一种人工老化模型，具有衰老变化明显、模型稳定、耗时短等优点。因此本研究对小鼠进行d-半乳糖注射进行造模，结果发现，造模2个月后模型组小鼠abr阈值显著升高，并且与对照组相比，存在显著性差异（p<0.01）。造模后模型组小鼠abr阈值变化稳定，与以往研究结果一致[7，8]，arhl小鼠模型造模成功。同时，本研究应用morris水迷宫结果发现，第1、2、3、4天arhl小鼠学习能力低于对照动物（p<0.05）;随着学习时间的延长，arhl小鼠潜伏期和上台前路程逐渐缩短，显示出学习的作用，而第4天arhl小鼠学习能力仍然显著低于对照组。但在第5天的记忆测试中，arhl小鼠在目标象限游泳时间和穿越平台次数显著低于对照组（p<0.05），显示arhl小鼠海马相关的空间学习能力及空间记忆能力显著降低。结果证实年龄相关性听力损失模型小鼠学习和记忆能力下降，记忆保持能力也有所下降。内质网是细胞内蛋白质合成、加工及修饰的场所，大量未折叠及错误折叠的蛋白质在内质网腔中聚集将会引起内质网应激（endoplasmicreticulumstress，ers）。ers参与诱导内耳毛细胞的凋亡，从而引起听力损失，也参与神经细胞的凋亡，影响智力发育，这可能是年龄相关性听力损失可以降低小鼠学习和记忆能力的潜在机制。综上所述，年龄相关性听力损失可以降低小鼠学习和记忆能力。因此临床上针对年龄相关性听力损失的老年患者要注意加强锻炼学习记忆能力，必要时采取适当治疗，改善认知功能，延缓阿尔茨海默病的发生。
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[6]taljaardds，olaithem.therelationshipbetweenhearingimpairmentandcognitivefunction：ameta-analysisinadults[j].clinotolaryngol，2016，41：718-729。
[7]黄双.d-半乳糖致小鼠衰老模型剂量和给药方式探讨[d].南宁：广西医科大学，2014。
[8]张海静，王哲，武莹，等.耳聋左慈丸对老年性耳聋模型小鼠血清sod，mda、pkc的影响[j].中国中医药现代远程教育，2016，14（l）：136-138。
[9]张博，陈颖，黄喜，等.参芎注射液对顺铂致小鼠耳毒性及耳蜗caspase-3表达的影响[j].实用临床医药杂志，2016，20（23）：1-4。
[10]于亚峰，翟丰，戴春富，等.c57bl/6j小鼠听力损失与认知功能下降的相关性[j].中华医学杂志，2011，91（34）：2430-2434。
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[14]gatesga，beisera，reests，etal.centralauditorydysfunctionmayprecedetheonsetofclinicaldementiainpeoplewithprobablealzheimer’sdisease[j].jamgeriatrsoc，2002，50（3）：482-488。
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